style="width:3.59334in;height:0.66682in" /> (1) 本文是学习GB-T 14700-2018 饲料中维生素B1的测定. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了用荧光分光光度法和高效液相色谱法测定饲料中维生素 B₁ 含量的两种方法。
本标准方法1适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中的维生素 B₁
的测定。方法的定量限为 1mg/kg
(在有吸附硫胺素或影响硫色素荧光干扰物质存在的情况，本方法不适用)。该方法所测定的
维生素B₁ 包括内源性以及添加量总和。
本标准规定的方法2适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料的测定。方法2的检出限为
3 mg/kg; 定量限为15 mg/kg。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
试样中的维生素 B₁
经稀酸以及消化酶分解、吸附剂的吸附分离提纯后，在碱性条件下被铁氰化钾
氧化生成荧光色素-硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的荧光强度与试样中维生素
B, 的含量
成正比，依此进行定量测定。
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，色谱用水应满足 GB/T6682
中一级水的要求；实验用
水应满足 GB/T 6682 中三级水的要求。
3.2.1 盐酸溶液 c(HCl)=0.1 mol/L。
3.2.2 硫酸溶液 c(1/2 H₂SO₄)=0.05 mol/L。
3.2.3 乙酸钠溶液 c(CH₃COONa)=2.0 mol/L。
3.2.4 100 g/L淀粉酶悬乳液：用乙酸钠溶液(3.2.3)悬浮10 g
淀粉酶制剂，稀释至100 mL, 使用当日 制备。
3.2.5 氯化钾溶液：250 g/L。
3.2.6 酸性氯化钾溶液：将8.5 mL
浓盐酸加入至氯化钾溶液(3.2.5)中，并稀释至1000 mL。
3.2.7 氢氧化钠溶液：150 g/L。
3.2.8 铁氰化钾溶液：10 g/L。
3.2.9 碱性铁氰化钾溶液：移取4.00mL
的铁氰化钾溶液(3.2.8)与氢氧化钠溶液(3.2.7)混合使之成
GB/T 14700—2018
3.2.10 冰乙酸溶液：30 mL/L。
3.2.11 酸性20%乙醇溶液：取80 mL 水，用盐酸溶液(3.2.1)调节 pH
3.5～4.3,与20 mL 无水乙醇 混合。
3.2.12 人造沸石[0.25 mm～0.18 mm(60
目～80目)]:使用前应活化，方法如下：将适量人造沸石置
于大烧杯中，加入10倍容积，加热到60℃~70℃的冰乙酸溶液(3.2.10),用玻璃棒均匀搅动10
min, 使
沸石在冰乙酸溶液中悬浮，待沸石沉降后，弃去上层冰乙酸液，重复上述操作2次。换用5倍容积，加热
到60℃~70℃的氯化钾溶液(3.2.5)搅动清洗2次，每次15 min。
再用热冰乙酸溶液洗10 min。 最后 用热水清洗沸石至无氯离子(用10 g/L
硝酸银水溶液检验)。用布氏漏斗抽滤，105℃烘干，贮于磨口 瓶可使用6个月。
使用前，检查沸石对维生素 B,
标准溶液的回收率，如达不到92%,应重新活化沸石。
注：沸石对维生素 B: 回收率的检查：移取维生素 B₁ 标准中间液(3.2.13.2)2
mL 用酸性氯化钾溶液(3.2.6)定容至 100mL。
按照3.5.4.1～3.5.4.3步骤进行氧化，作为外标。另一份维生素 B₁
标准工作液(3.2.13.3)移取25 mL
3.5.3.1 ～[3.5.3.3](https://3.5.3.3
计算，经换算为百分数就是沸石对维生素 B₁ 的回收率值。
3.2.13 维生素 B, 标准溶液
3.2.13.1 维生素 B,
标准贮备液：取硝酸硫胺素标准品(纯度大于99%),于五氧化二磷干燥器中干燥
24 h。称取0.01g (精确至0.0001 g),
溶解于酸性20%乙醇溶液(3.2.11)中并定容至100 mL, 盛于棕色
瓶中，2℃~8℃冰箱保存，可使用3个月。该溶液含0.1 mg/mL 维生素 B₁。
3.2.13.2 维生素 B₁ 标准中间液：取维生素 B₁
标准贮备液(3.2.13.1)10 mL 用酸性20%乙醇溶液(3.2. 11)定容至100 mL,
盛于棕色瓶中，2℃~8℃冰箱保存，可使用48 h。 该溶液含10μg/mL 维生素 B。
3.2.13.3 维生素 B₁ 标准工作液：取维生素 B₁
标准中间液(3.2.13.2)2 mL 与 6 5 mL 盐酸溶液(3.2.1) 和 5 mL
乙酸钠溶液(3.2.3)混合，定容至100 mL, 分析前制备。该溶液含0.2μg/mL 维生素
B₁。
3.2.14 硫酸奎宁溶液
3.2.14.1 硫酸奎宁贮备液：称取硫酸奎宁0.1 g
(精确至0.001 g), 用硫酸溶液(3.2.2)溶解并定容至
1000mL。 贮于棕色瓶中，冷藏。若溶液混浊则需要重新配制。
3.2.14.2 硫酸奎宁工作液：取贮备液(3.2.13.1用硫酸溶液(3.2.2)定容至1000 mL 。 贮于棕色 瓶中，冷藏。该溶液含0.3μg/mL
硫酸奎宁。
3.2.15
正丁醇：荧光强度不超过硫酸奎宁工作液(3.2.14.2)的4%,否则需用全玻璃蒸馏器重蒸馏，取
114℃~118℃馏分。
3.3.1 实验室常用玻璃器皿。
3.3.2 分析天平：感量0.0001 g,0.001 g。
3.3.3 高压釜，使用温度为121℃~123℃或压力达到15kg/cm²。
3.3.4 电热恒温箱，45℃~50℃。
3.3.5 吸附分离柱：全长235 mm, 外径×长度如下：上端贮液槽尺寸为35 mm×70
mm,容量约为
50mL, 中部吸附管8 mm×130 mm;下端35 mm 拉成毛细管。
3.3.7 荧光分光光度计，备1 cm 石英比色杯。
按照GB/T 14699.1 抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按 GB/T
20195 制备试样，粉
GB/T 14700—2018
碎过0.425 mm 孔径筛，充分混匀。
称取原料、配合饲料、浓缩饲料1 g～2g, 精确至0.001 g,置于100 mL
棕色锥形瓶中。
3.5.2.1 水解：加入盐酸溶液(3.2.1于锥形瓶中，加塞后置于沸水浴加热30 min [或于高压釜 (3.3.2)中加热30
min], 开始加热5 min～10 min 内不时摇动锥形瓶，以防结块。
3.5.2.2 酶解：冷却锥形瓶至50℃以下，加5 mL
淀粉酶悬浮液(3.2.4),摇匀。该溶液 pH 约为4.0~
4.5,将锥形瓶至于电热恒温箱(3.3.4)中45℃~50℃保温3
h,取出冷却，用盐酸溶液(3.2.1)调整 pH 至3.5,转移至100 mL
棕色容量瓶中，用水定容至100 mL, 摇匀。
3.5.2.3
过滤：将全部试液通过无灰滤纸过滤，弃去初滤液5 mL, 收集滤液作为试样溶液。
3.5.3.1 制备吸附柱：称取1.5 g
活化人造沸石(3.2.12)置于50 mL 小烧杯中，加入3%冰乙酸溶液
(3.2.10)浸泡，溶液液面没过沸石即可。将脱脂棉置于吸附分离柱(3.3.5)底部，用玻璃棒轻压。然后将
乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中(勿使吸附柱脱水),过柱流速控制在1 mL/min
为宜。再用10 mL 近沸 的水洗柱1次。
3.5.3.2 吸取25 mL
试样溶液(3.5.2.3),慢慢加入制备好的吸附柱中，弃去滤液，用每份5 mL 近沸的
水洗柱3次，弃去洗液。同时做平行样。
3.5.3.3 用 2 5 mL60℃~70℃
酸性氯化钾溶液(3.2.6)分3次连续加入吸附柱，收集洗脱液于25 mL
容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾溶液定容，混匀。
3.5.3.4 同时用25 mL 维生素 B₁
标准工作液(3.2.13.3)。重复3.5.3.1～3.5.3.3操作，作为外标。
警示—— 以下操作避光进行。
3.5.4.1 于2只具塞离心管(3.3.6洗脱液(3.5.3.3),分别标记为 A、B。
3.5.4.2 在 B 管加入3 mL 氢氧化钠溶液(3.2.7A 管中加3 mL 碱性铁氰化钾溶液(3.2.9),轻轻 旋摇。依次立即向A 管加入15 mL
正丁醇(3.2.15)加塞，剧烈振摇15 s,再 向B 管加入15 mL 正丁醇
加塞，共同振摇90 s,静置分层。
3.5.4.3
用注射器(3.3.8)吸去下层水相，向各反应管加入约2 g
无水硫酸钠，旋摇，待测。
3.5.4.4 同 时 将 5 mL
作为外标的洗脱液(3.5.3.4),置入另2只具塞离心管，分别标记为 C 、D, 按
3.5.4.1 ～[3.5.4.3](https://3.5.4.3
3.5.5.1
用硫酸奎宁工作液(3.2.14.2)调整荧光仪，使其固定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。
3.5.5.2 于激发波长365 nm, 发射波长435 nm 处测定A
管 、B 管 、C 管 、D 管中萃取液的荧光强度。
本方法测定的维生素 B₁ 以硝酸硫胺素计，如需要以盐酸硫胺素计，按1 mg
盐酸硫胺素含1.03 mg
硝酸硫胺素换算。
GB/T 14700—2018
试样中维生素 B, 含量按式(1)计算：
style="width:3.59334in;height:0.66682in" /> (1)
式中：
w;—— 试样中维生素 B₁ 的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);
T₁— A 管试液的荧光强度；
T₂— B 管试液空白的荧光强度；
T₃— C 管标准溶液的荧光强度；
T₄— D 管标准溶液空白的荧光强度；
p — 维生素 B₁ 标准工作液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
V。——提取液总体积，单位为毫升(mL);
V₁— 分取溶液过柱的体积，单位为毫升(mL);
V₂—— 酸性氯化钾洗脱液体积，单位为毫升(mL);
m - 试样质量，单位为克(g)。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
对于维生素 B₁ 含量低于5mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的2次独立测定结果与其算术平
均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的15%;
对于维生素 B₁ 含量大于5 mg/kg 而小于50 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的2次独立测
定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%;
对于维生素 B₁ 含量大于50 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的2次独立测定结果与其算术
平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。
试样经酸性提取液超声提取后，将过滤离心后的试液注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分
离，用紫外(或二极管矩阵检测器)检测，外标法计算维生素 B₁ 的含量。
除特殊说明外，所用试剂均分析纯，色谱用水符合GB/T 6682 中一级用水规定。
4.2.2 庚烷磺酸钠(PICB₇): 优级纯。
4.2.6 酸性乙醇溶液：20%,制备见3.2.11。
4.2.7 二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA): 优级纯。
称取50 mg EDTA(4.2.7)于 1 0 0 0 mL 容量瓶中，加入约1000 mL
去离子水，同时加入25 mL 冰
乙酸(4.2.3)、约10 mL 三乙胺(4.2.4),超声使固体溶解，调节溶液 pH3～4,
过0 . 45 μm 滤膜，取
800 mL 该溶液，与200 mL 甲醇混合既得。
GB/T 14700—2018
称取107 g 氯化铵(4.2. 1)溶解于1000 mL 水中，用2 mol/L 盐酸调节溶液 pH
为3～4。取
900 mL 氯化铵溶液与100 mL 甲醇混合既得。
4.2.10 流动相：
称取庚烷磺酸钠(4.2.2)1.1 g、50 mg EDTA于1000 mL 容量瓶中，加入约1000 mL
水，同时加入 25mL 冰乙酸(4.2.3)、约10 mL
三乙胺(4.2.4),超声使固体溶解，pH 计调节溶液 pH 为3 . 7,过
0.45μm 滤膜，取800 mL 该溶液，与200 mL 甲醇(4.2.5)混合既得。
4.2.11 维生素 B₁ 标准溶液
4.2.11.1 维生素 B₁
标准贮备液：制备过程同3.2.13.1。
4.2.11.2 维生素 B₁ 标准工作液 A: 准确吸取1 mL
维生素 B₁ 标准贮备液(4.2.11.1)于50 mL 棕色容
量瓶中，用流动相(4.2.10)定容至刻度，该标准工作液浓度为20μg/mL,
该溶液存于2℃~8℃冰箱可 以使用48 h。
4.2.11.3 维生素B, 标准工作液B: 准确吸取5 mL
维生素 B, 标准工作液A(4.2.11.2)于50 mL 棕色容
量瓶中，用流动相(4.2.10)定容至刻度，该标准工作液浓度2.0μg/mL,
该溶液使用前稀释制备。
4.3.1 实验室常用玻璃器皿。
4.3.2 pH 计(带温控，精准至0.01)。
4.3.4 针头过滤器备0.45 μm (或0.2 μm) 滤膜。
4.3.5 高效液相色谱仪带紫外或二极管矩阵检测器。
按照GB/T 14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按 GB/T
20195 制备试样，充
分混匀。
警示——避免强光照射。
4.5.1.1 维生素预混合饲料的提取
称取试样0.25 g～0.5 g(精确到0 .0001 g), 置于100 mL
棕色容量瓶中，加入提取液(4.2.8)约 70mL,
边加边摇匀，置于超声水浴中超声提取15 min,
期间摇动2次，冷却，用提取液定容至刻度，摇
匀。取少量溶液于离心机上8000 r/min 离 心 5 min, 上清液过0.45 μm
微孔滤膜，上 HPLC 测定。
4.5.1.2 复合预混合饲料的提取
称取试样约3.0 g (精确到0.001 g),置于100 mL
棕色容量瓶中，加入提取液(4.2.9)约70 mL, 边加
边摇匀后置于超声水浴中超声提取30
min,期间摇动2次，冷却，用提取液定容至刻度，摇匀。取少量
溶液于离心机上8000 r/min 离 心 5 min, 上清液过0.45μm 微孔滤膜，上 HPLC
测定。
色谱柱：Cis柱，长250 mm, 内径4.6 mm, 粒度5μm
(或相当性能类似的分析柱)。
GB/T 14700—2018
流动相：4.2.10。
流速：1.0 mL/min。
温度：25℃~28℃。
检测波长：242 nm。
进样量：20 μL。
平衡色谱柱后，依分析物浓度向色谱柱注入相应的维生素 B, 标准工作液
A(4.2. 11.2) 或者维生素 B. 标准工作液 B(4.2. 11.3)
和试样溶液(4.5.1),得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定，维生素 B₁
色谱图参见附录 A。
本方法测定的维生素 B. 以硝酸硫胺素计，如需要以盐酸硫胺素计，按1 mg
盐酸硫胺素含1.03 mg
硝酸硫胺素换算。
试样中维生素 B₁ 的含量，按式(2)计算：
style="width:2.00002in;height:0.64658in" /> (2)
式中：
w— 为维生素 B₁ 质量分数，单位为毫克每千克(mg/kg);
m—— 试样质量，单位为克(g);
V— 稀释体积，单位为毫升(mL);
p— 维生素 B₁ 标准工作液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
P₁—— 试样溶液峰面积值；
P₂— 维生素 B, 标准工作液峰面积值。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
对于维生素 B₁ 含量低于5 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的2次独立测定结果与其算术平
均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的15%;
对于维生素 B₁ 含量大于5 mg/kg 而小于50 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的2次独立测
定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%;
对于维生素 B₁ 含量大于50 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的2次独立测定结果与其算术
平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。
GB/T 14700—2018
(资料性附录)
维生素 B, 标准色谱图和光谱图
维生素 B₁ 标准色谱图见图 A.1; 维 生 素 B₁ 标准光谱图见图 A.2。
style="width:8.78675in;height:5.9532in" />
时 间 /min
图 A.1 22 μg/mL 维 生 素 B,
标准色谱图(在6种水溶性维生素混合标准品中 )
style="width:8.79997in;height:5.22654in" />
波 长 /nm
图 A.2 维 生 素 B, 标准光谱图
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